鸡马立克病毒（MDV）核酸扩增检测试剂盒（荧光-PCR 法）说明书

鸡马立克病毒（MDV）核酸扩增检测试剂盒（荧光-PCR 法）

【产品名称】

通用名称：鸡马立克病毒（MDV）核酸检测试剂盒（荧光-PCR 法）

Name ：Marek's Disease Virus Detection Kit（Real-Time PCR Method）

【包装规格】48T/盒

【预期用途】

鸡马立克氏病是由鸡马立克氏病病毒引起的一种鸡的恶性淋巴肿瘤性疾病，属于α疱疹病毒属，具有高度的接触传染性。ＭＤ以淋巴细胞组织增生，在各内脏器官以及外周神经、肌肉、皮肤、性腺、虹膜中产生单核细胞浸润和肿瘤为特征[1-2]。ＭＤ 在世界各地广泛流行，对养禽业造成巨大的经济损失。同时该病也是目前唯-一可以用疫苗来预防的肿瘤性疾病。本试剂盒利用实时荧光 PCR 原理，检测马立克氏病病毒， 对鸡马立克氏病的诊断有重要指导意义。

【检验原理】

本试剂盒针对马立克病毒基因高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系   中含马立克病毒基因组模板的情况下，PCR 反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对 PCR 过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性、定量分析。

【试剂组成】

名称规格

核酸提取液1.5mL×2 管

酶液50μL×1 管

MDV 反应液1.0mL×1 管

MDV 阳性质控品50μL ×1 管

阴性质控品250μL ×1 管

注：

1）不同批号试剂不能混用。

2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

剪取肿瘤组织、病变淋巴结组织。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

组织样品：每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 50μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；

1.2DNA 提取

1）对上述处理好的标本加入 50μL 核酸提取液，100℃恒温处理 10min，13,000 rpm 离心 5min，取上清液转移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存；

2）DNA 的提取也可以采用公司生产的 DNA 提取试剂盒（离心柱提取法），请按照试剂盒说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂MDV 反应液酶液

用量（样本数为 N）20μL1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。

3.加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye） NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3推荐循环参数设置：

步骤循环数温度时间收集荧光信号

11 cycle95℃10min否

240 cycles94℃15sec否

55℃30sec是

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.15.2 结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；

可疑：检测通道 35<Ct 值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为 35<Ct 值≤38， 且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性；

阴性：样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。

6.质控标准

阴性质控品：Ct>38 或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7.检测方法的局限性

样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定   量检测不准确的结果；

本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

所有操作严格按照说明书进行；

试剂盒内各种组分使用前应自然融化，wan全混匀并短暂离心；

反应液应避光保存；

反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通   则》进行处理。

【参考文献】

[1]Abdul-Careem M F, Read L R, Parvizi P, et al. Marek's disease virus induced expression of cytokine gene in feather of genetically defined chickens [J]. Dev Comp Immunol, 2009, 33(4): 618-623.

[2]Davison A J, Eberle R, Ehlers B, et al. The order herpes virales [J]. Arch Virol, 2009(154):171-177.