鸡毒支原体(MG)核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）说明书

鸡毒支原体(MG)核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）

商品名称：鸡毒支原体(MG)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)

Name ：Mycoplasma gallisepticam Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】50T/盒

【预期用途】

鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum, MG）是引起鸡慢性呼吸道疾病的主要病原，引起鸡呼吸道粘膜卡他性炎症，造成肉鸡胴体品质下降，种鸡产蛋率、受精率和孵化率下降等。MG 是高度传染性病原，可随尘粒、空气和羽毛在鸡群中水平传播，也可随种蛋垂直传播。MG 定植鸡的呼吸道后，导致呼吸道上皮细胞纤毛活动减弱或停滞，引起鸡群继发大肠杆菌感染或鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒感染，引起严重的并发症，导致鸡群死亡率增高，给养鸡业造成严重的经济损失。

本试剂盒适用于检测鼻腔、眶下窦、气管或气囊组织、眶下窦和关节渗出物或结膜囊内冲洗物、鼻腔、食   管、气管、泄殖腔和交合器拭子、卵黄囊内表面等样本中的鸡毒支原体，用于鸡毒支原体感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒对鸡毒支原体基因保守区设计特异性的引物和探针，用荧光 PCR 技术对鸡毒支原体的核酸进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染病料的病原学诊断。

【试剂组成】

包装规格50T/盒

MG 反应液500μL×2 管

酶液50μL×1 管

MG 阳性质控品50μL ×1 管

阴性质控品250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

病死或扑杀禽，从鼻腔、眶下窦、气管或气囊取样，也可吸取眶下窦和关节渗出物或结膜囊内冲洗物；活   禽从鼻腔、食管、气管、泄殖腔和交合器中取样；鸡胚从卵黄囊内表面、口咽和气囊采样。

【保存和运输】

采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

组织样品：每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL灭菌离心管中；液体样品，直接取 100μL 提取。

1.2核酸提取

推荐采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的核酸提取试剂（离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明书    进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂MG 反应液酶液

用量（样本数为 N）19μL1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。

3.加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。

4.PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择

ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3推荐循环参数设置：

步骤循环数温度时间收集荧光信号

11 cycle95℃2min否

245 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。

5.3质控标准

阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

6.检测方法的局限性

样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完-全混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【生产企业】

企业名称：优利科（上海）生命科学有限公司