禽腺病毒 C 种 4 型（FADV-C-4） 核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）说明书

禽腺病毒 C 种 4 型（FADV-C-4） 核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）

【产品名称】

商品名称：禽腺病毒 C 种 4 型（FADV-C-4）核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法) Name ：Avian adenovirus C type 4 Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】25T/盒、50T/盒

【预期用途】

禽腺病毒 C 种 4 型(Avian adenovirus C type 4 , FADV-C-4)属于腺病毒科禽腺病毒属，为双链 DNA 病毒，分为 3 个群。自 2013 年，国内鸡群由禽腺病毒（FADV）引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多[1]。而到 2015 年，高致病性血清４型 FADV 引起的肝炎－心包积综合症已在国内鸡群爆发，对养禽业的发展构成严重威胁[2-3]。

本试剂盒适用于检测的禽类动物肺、脾、脑等组织、呼吸道分泌物、全血等标本中禽腺病毒 C 种 4 型 DNA， 适用于禽腺病毒 C 种 4 型感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒用一对禽腺病毒 C 种 4 型特异性引物，结合一条特异性荧光探针，用一步法荧光PCR 技术对禽腺病毒 C 种 4 型病毒 DNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

包装规格25T/盒50T/盒

FADV-C-4 反应液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

FADV-C-4 阳性质控品50μL ×1 管50μL ×1 管

阴性质控品250μL ×1 管250μL ×1 管

注：

1）不同批号试剂不能混用。

2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

病死或扑杀禽，取肺、脾、脑等组织；待检活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物，放于 1mL50%甘油生理盐水中；用注射器取血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输， 严禁反复冻融。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；棉拭子直接取 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；全血样品待血凝后取血清 100μL，置于 1.5mL 离心管中。 

1.2核酸提取

推荐采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按    照试剂说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂NDV 反应液酶液

用量20μL1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。

3.加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，

短暂离心。

4.PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3推荐循环参数设置：

步骤循环数温度时间收集荧光信号

11 cycle95℃10min否

240 cycles94℃15sec否

55℃30sec是

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；

可疑：检测通道 35<Ct 值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为 35<Ct 值≤38，且曲线有明显的增长曲线， 判定为阳性，否则为阴性；

阴性：样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。

6.质控标准

阴性质控品：Ct>38 或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7.检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完-全混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

[1]赵继勋.Ⅰ群禽腺病毒感染的流行病学探究与防控认识[J]. 北方牧业, 2017(6): 18.

[2]楚电峰, 刘相娥, 薄智勇, 等.Ⅰ群禽腺病毒的流行病学和防控研究现状[J]. 中国动物检疫, 2017,34(5): 86-89.

[3]王亚楠, 韩涛, 李纯玲, 等. 禽腺病毒Ⅰ群的研究现状[J]. 中国动物保健, 2017, 19(1): 61-64.