鸭疫里默氏杆菌（RA）核酸检测试剂盒说明书

鸭疫里默氏杆菌（RA）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）

【产品名称】

商品名称：鸭疫里默氏杆菌（RA）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）

Name   ：Riemerella anatipestifer Detection Kit(Real-Time PCR Method)

【包装规格】25T/盒、50T/盒

【预期用途】

鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的鸭、鹅、火鸡等多种禽类的一种急性或慢性传染病，也称新鸭病、鸭败血症、鸭疫综合征、鸭疫败血症和传染性浆膜炎。其主要病理特征是急性或慢性败血症、纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和脑膜炎，还可以引起干酪性输卵管炎、关节炎、结膜炎等。发病率为 5%～90%，病死率高达 80%，给世界养鸭业造成了巨大的经济损失，鸭疫里氏杆菌病已成为危害养鸭业的主要细菌性传染病之一。

本试剂盒适用于检测鸭疫里默氏杆菌病的肝脏、脾脏等脏器组织中鸭疫里默氏杆菌 DNA 的检测，适用于鸭疫里默氏杆菌感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒对鸭疫里默氏杆菌特异核酸序列设计引物和探针，用荧光 PCR 技术对鸭疫里默氏杆菌 DNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染病料的病原学诊断。

【试剂组成】

包装规格25T/盒50T/盒

RA 反应液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

RA 阳性质控品50μL ×1 管50μL ×1 管

阴性质控品250μL ×1 管250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃避光保存，有效期 12 个月。避免反复冻融，冻融次数不超过 5 次。

【适用仪器】

ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

按 NY/T 541 要求无菌采集发病鸭的肝脏或脑（有典型纤维素性渗出时采集肝脏，有神经症状时采集脑）。

【保存和运输】

采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

无菌取疑似鸭疫里默氏杆菌病的肝脏、脾脏等脏器组织 1.0 g～5.0 g，按 10%（g/mL）加入 PBS，研磨匀浆。

-20 ℃保存备用。

1.2核酸提取

推荐采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取， 请按照试剂说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满

10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂RA 反应液酶液

用量19μL1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。

3.加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。

4.PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3推荐循环参数设置：

步骤循环数温度时间收集荧光信号

11 cycle95℃2min否

245 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数器，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。

5.3质控标准

阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

6.检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完-全混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

[1] 山东省市场监督管理局. DB37/T 3880-2020, 鸭疫里默氏杆菌病诊断技术规程[S].