鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌（SP/SG）核酸检测试剂盒说明书

鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌（SP/SG）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）

【产品名称】

商品名称：鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌（SP/SG）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）

Name ：S.Gallinarum-Pullorum Nucleic Acid Detection Kit （Real-Time PCR Method）

【包装规格】25T/盒、50T/盒

【预期用途】

由沙门氏菌属的某些致病性沙门氏菌引起的鸡群细菌性传染病称为鸡沙门氏菌病，一般分为鸡白痢、鸡伤寒和副伤寒三种病型，其中以鸡白痢和鸡伤寒发病较多，危害较强。鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌（S.Pullorum）感染鸡群引起的，主要是侵害雏鸡。2 周以下的雏鸡发病后死亡率可达 40%-70%，受感染的雏鸡在 4-7 天死亡，急性时可在 1-3 天死亡。鸡伤寒沙门氏菌（S.Gallinarum）感染鸡群可引起鸡伤寒病症，主要是感染成年鸡，雏鸡有时也会被感染， 出壳后几天开始发病， 死亡率较高。 现在， 这两种致病菌统称为鸡- 雏沙门氏

（S.Gallinarum-Pullorum），没有鞭毛，不会运动，只会感染鸡群，可存在于卵巢、睾丸、肝脏等器官中，能够通过亲代感染子代，因此对养鸡业的危害极大。

本试剂盒适用于肝脏、脾脏等组织样品以及肠内容物样品，粪便样品，泄殖腔拭子样品等样品中的鸡白痢/      鸡伤寒沙门氏菌，用于鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，设计一对鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光 PCR 技术对鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌的 DNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染病料的病原学诊断。

【试剂组成】

包装规格25T/盒50T/盒

SP/SG 反应液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

SP/SG 阳性质控品50μL ×1 管50μL ×1 管

阴性质控品250μL ×1 管250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

组织样品：选择具有典型临床症状的病死鸡，无菌取其肝脏、脾脏等组织样品，放置于无菌容器内，标记好   组织名称和采样日期，冷藏运送到实验室进行检测。

肛拭子样品：采集肛拭子样品时，取无菌棉拭子插入畜禽肛-门或泄殖腔中，旋转 2 圈~3 圈，刮取直肠黏液或粪便，放入装有 30%甘油磷酸盐缓冲液或半固体培养基中送检。

肠内容物样品：取肠内容物时，应烧烙肠壁表面，用吸管中扎穿肠壁。从肠腔内吸取内容物放入盛有灭菌的

30%甘油磷酸盐缓冲液或半固体培养基中送检或将带有粪便的肠管两端结扎，从两端剪断送检。

粪便样品：应选新鲜粪便至少 10g，运送粪便样品可用带螺帽容器或灭菌塑料袋，不得用带皮塞的试管。

【保存和运输】

采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

组织样品：每份组织分别从不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；水样便 13000rpm 离心 2min，去尽上清；其它样品处理参考 NY/T541-2016。

1.2核酸提取

推荐采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请   按照试剂说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N（N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表：

试剂SP/SG 反应液酶液

用量（样本数为 N）19μL1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。

3.加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；

荧光通道选择：检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX

参比荧光，选择 None 即可。

4.3推荐循环参数设置：

步骤循环数温度时间收集荧光信号

11 cycle95℃2min否

245 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。

5.3质控标准

阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

6.检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完-全混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

[1] 国家质量监督检验检疫总局. GB/T 40049-2021 鸡肠炎沙门氏菌 PCR 检测方法[S]