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禽白血病病毒通用型(ALV)核酸检测试剂盒说明书

发布时间:2024/11/4      点击次数:54

禽白血病病毒通用型(ALV)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)

【产品名称】

商品名称:禽白血病病毒通用型(ALV)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法) 

Name :Avian Leukosis Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】50T/盒

【预期用途】

禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus, ALV)是引发禽类发生肿瘤性疾病的一种重要病原,同时能导致感染机体发生严重的细胞和体液免疫抑制以及生长抑制,进而易与其它病原如马立克病病毒(MDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)等并发或混合感染。目前,还没有有效的疫苗和药物用于 ALV 防治,主要通过不断检测并淘汰阳性鸡来不断净化鸡群。荧光 PCR 技术因灵敏度高、特异性强、操作方便成为禽白血病病原检测的重要手段。本试剂盒可以检测包括 A 亚型、B 亚型、C 亚型、D 亚型、E 亚型以及 K 亚型和 J 亚型在内的多种禽白血病分型。

本试剂盒适用于检测的全血、带有白血细胞的血浆或血清、脾脏、肝脏、肾脏等标本中禽白血病病毒,适   用于禽白血病病毒感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒用一对禽白血病病毒特异性引物,结合一条特异性荧光探针,用一步法荧光 RT-PCR 技术对禽白血病病毒 RNA 进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染病料的病原学诊断。

【试剂组成】

包装规格50T/盒

ALV 反应液500μL×2 管

酶液50μL×1 管

ALV 阳性质控品50μL ×1 管

阴性质控品250μL ×1 管

说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

疑似病鸡的全血、带有白血细胞的血浆或血清;疑似病鸡的脾脏、肝脏、肾脏。

【保存和运输】

采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h;若需长期保存,应放置-70℃以下保存,冻融不超过 3 次。

【使用方法】

1.样品处理(样本处理区)

1.1样本前处理

每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g,手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中,8000rpm 离心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中;全血样品待血凝后取血清 100μL,置于 1.5mL 离心管中。

1.2核酸提取

推荐采用优利科(上海)生命科学有限公司生产的核酸提取试剂(离心柱法)进行核酸提取,请按照试剂说明书    进行操作。

2.试剂配制(试剂准备区)

根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;反应管数每满 10 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:

试剂ALV 反应液酶液

用量19μL1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,20μL/管。

3.加样(样本处理区)

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀, 短暂离心。

4.PCR 扩增(核酸扩增区)

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;

4.2设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;荧光通道选择:

检测通道(Reporter Dye)FAM, 淬灭通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光,请选择 NONE。

4.3推荐循环参数设置:

步骤循环数温度时间收集荧光信号

11 cycle50℃10min

21 cycle95℃2min

345 cycles95℃15sec

60℃30sec

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定(请参照各仪器使用说明书进行设置,以分析 ABI7500 仪器为例)

反应结束后自动保存结果,根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用户可根据实际情况自行调整,Start 值可设在 3~15、End 值可设在 5~20,使阈值线位于扩增曲线指数期,阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线),点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2结果判断

阳性:检测通道 Ct 值≤40,且曲线有明显的指数增长曲线; 阴性:样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。

5.3质控标准

阴性质控品:无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示;

阳性质控品:扩增曲线有明显指数增长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。

6.检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;

3.阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;

4.病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;

5.不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;

6.试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;

7.本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行;

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化,wan全混匀并短暂离心;

3.反应液应避光保存;

4.反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。


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