新城疫中强毒株（NDV-M）核酸检测试剂盒说明书

【产品名称】

商品名称：新城疫中强毒株（NDV-M）核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)

Name：Newcast Deaseace Virus Mesogenic and Virulent Strains Detection Kit (Real-Time RT-PCR Method)

【包装规格】25T/盒、50T/盒

【预期用途】

新城疫是由新城疫病毒(New castle disease viurs, NDV)引起的一种禽类急性、高度接触性传染病。ND 常呈败血症经过,以呼吸困难、神经机能紊乱、粘模和浆膜出血等为主要特征[1]。根据病毒株致病力的差异，将 NDV 分为强毒力型、中等毒力型及弱毒力型。NDV 中强毒株在鸡群中传播迅速，危害严重；而弱毒株仅引起鸡群呼吸道感染和产蛋量下降，多与其它疾病共同发病而造成一定的危害[1-3]。

本试剂盒适用于检测的禽类动物肺、脾、脑等组织、呼吸道分泌物、全血等标本中新城疫中强毒株，适用于新城疫中强毒感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒对新城疫中强毒 F 基因裂解位点设计特异性引物和探针[1-2]，用一步法荧光 RT-PCR 技术对新城疫中强毒进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染病料的病原学诊断。

【试剂组成】

包装规格25T/盒50T/盒

NDV-M 反应液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

NDV-M 阳性质控品50μL ×1 管50μL ×1 管

阴性质控品250μL ×1 管250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

病死或扑杀禽，取肺、脾、脑等组织；待检活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物，放于 1mL50%甘油生理盐水中；用注射器取血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管。

【保存和运输】

采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；棉拭子直接取 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；全血样品待血凝后取血清 100μL，置于 1.5mL 离心管中。

1.2核酸提取

推荐采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取， 请按照试剂说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满

7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂NDV-M 反应液酶液

用量19μL1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL /管。

3.加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。

4.PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择：检测通道（ReporterDye）FAM，淬灭通道

（QuencherDye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3推荐循环参数设置：

步骤循环数温度时间收集荧光信号

11 cycle50℃10min否

21 cycle95℃2min否

345 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。

5.3质控标准

阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

6.检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完-全混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

[1]曹军平,胡新岗,吴双,等.荧光定量 RT-PCR 检测中、强毒力新城疫病毒方法的建立及验证.中国动物检疫,2012. [2]辽宁质量监督局.DB21/T2465-2015 新城疫强弱毒株 RT-PCR 鉴别诊断技术[S].

[3] Kant A G, Koch D J. Differentiation of virulent and non-virulent strains of NDV within 24 hours by PCR [J].AvianPathol,1997,26:837-849.