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禽-流感病毒通用型(AIV-U)核酸检测试剂盒说明书

发布时间:2024/11/9      点击次数:69

【产品名称】

商品名称: 禽-流-感病毒通用型(AIV-U)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)

Name: Avian Influenza Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】50T/盒

【预期用途】

禽-流-感是禽类流行型感冒的简称,它是由甲型流感病毒的一种亚型(也称禽-流-感病毒)引起的一种急性传染病,经变异后也能感染人类,被国际兽疫局定为甲类传染病。禽-流-感病毒(AIV)为正粘病毒科甲型流感病毒属,单股 负链 RNA 病毒。依据其外膜血凝素(H)和神经氨酸酶(N)蛋白可分为 H 亚型和 N 亚型,目前已发现 18 个 HA 和 11 个 NA 亚型。

本试剂盒适用于检测拭子样品、气管、肺、脑、肠(包括内容物)、肝、脾、肾、心等组织脏器中禽-流-感病   毒 RNA,适用于禽-流-感病毒感染的诊断、检疫、检测、监测和流行病学调查等。

【检验原理】

本试剂盒针对禽-流-感病毒 M 基因高度保守区域设计特异性引物和探针,用一步法荧光 RT-PCR 技术对禽-流-感病毒 RNA 进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染病料的病原学诊断。

【试剂组成】

包装规格50T/盒

AIV-U 反应液500μL×2 管

酶液50μL×1 管

AIV-U 阳性质控品50μL ×1 管

阴性质控品250μL ×1 管

说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】】

-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

拭子样品:采集咽喉拭子时将拭子每人喉头及上颚裂来回刮 2 次~3 次并旋转,取分泌液;采集泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔至少旋转 3 圈并沾取少量粪便;将采样后的拭子分别放入盛有 1.2 mL 样品稀释液(配制方法见 GB/T 18936-2020 高致病性禽-流-感诊断技术)的 2 mL 采样管中,编号并填写相应采样单。

发病禽鸟可无菌采集气管、肺、脑、肠(包括内容物)、肝、脾、肾、心等组织脏器,装入 15 mL 或 50 mL

带螺口的有机材料保存管中,编号并填写相应采样单。

【保存和运输】

采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h;若需长期保存,应放置-70℃以下保存,冻融不超过 3 次。

【使用方法】

1.样品处理(样本处理区)

1.1样本前处理

将棉拭子充分捻动、挤干后弃去拭子;粪便,研碎的组织加 PBS 充分研磨,按照 1g 组织加 10 mL PBS 的比例配成悬液。样品液经 3 000 r/min 离心 10 min,取上清作为核酸检测材料。

1.2核酸提取

推荐采用优利科(上海)生命科学有限公司生产的核酸提取试剂(离心柱法)进行核酸提取,请按照试剂说明书    进行操作。

2.试剂配制(试剂准备区)

根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;反应管数每满 10 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:

试剂AIV-U 反应液酶液

用量19μL1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,20μL /管。

3.加样(样本处理区)

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,

短暂离心。

4.PCR 扩增(核酸扩增区)

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;

4.2设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;荧光通道选择:检测通道(ReporterDye)FAM,淬灭通道

(QuencherDye)NONE,ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光,选择 None 即可。

4.3推荐循环参数设置:

步骤循环数温度时间收集荧光信号

11 cycle50℃10min

21 cycle95℃2min

345 cycles95℃15sec

60℃30sec

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定(请参照各仪器使用说明书进行设置,以分析 ABI7500 仪器为例)

反应结束后自动保存结果,根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用户可根据实际情况自行调整,Start 值可设在 3~15、End 值可设在 5~20,使阈值线位于扩增曲线指数期,阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线),点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2结果判断

阳性:检测通道 Ct 值≤40,且曲线有明显的指数增长曲线; 阴性:样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。

5.3质控标准

阴性质控品:无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示;

阳性质控品:扩增曲线有明显指数增长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。

6.检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;

3.阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;

4.病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;

5.不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;

6.试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;

7.本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行;

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完-全混匀并短暂离心;

3.反应液应避光保存;

4.反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

[1] 国家质量监督检验检疫总局. GB/T 18936-2020 高致病性禽-流-感诊断技术[S].


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