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甲型流感病毒N6亚型(IAV-N6)核酸检测试剂盒说明书

发布时间:2024/11/14      点击次数:53

甲型流感病毒 N6 亚型(IAV-N6)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)

【产品名称】

商品名称:甲型流感病毒 N6 亚型(IAV-N6)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)

Name   :Avian Influenza Virus subtype N6 Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】25T/盒、50T/盒

【预期用途】

甲型流感病毒(Influenza A virus)为常见流感病毒,甲型流感病毒最容易发生变异,甲型流感病毒的亚型则被人们称为“禽-流感",禽-流感(Bird Flu)是由禽-流感病毒引起的一种急性传染病,病毒基因变异后能够感染人类, 感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等,多数伴有严重的肺炎,严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡,病死率很高。此病可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播,人员和车辆往来是传播本病的重要因素。本试剂盒利用实时荧光 PCR 原理,检测 N6 亚型流感病毒,对甲型流感病毒 N6 亚型引起的流感诊断有重要指导意义。

【检验原理】

本试剂盒针对甲型流感病毒 N6 亚型 NA 基因高度保守区域设计特异性引物和探针,在反应体系中含甲型流感病毒 N6 亚型基因组模板的情况下,PCR 反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对 PCR 过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出,实现检测结果的定性、定量分析。

【试剂组成】

包装规格25T/盒50T/盒

IAV-N6 反应液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

IAV-N6 阳性质控品50μL ×1 管50μL ×1 管

阴性质控品250μL ×1 管250μL ×1 管

说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

拭子样品:采集咽喉拭子时将拭子每人喉头及上颚裂来回刮 2 次~3 次并旋转,取分泌液;采集泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔至少旋转 3 圈并沾取少量粪便;将采样后的拭子分别放入盛有 1.2 mL 样品稀释液(配制方法见 GB/T 18936-2020 高致病性禽-流感诊断技术)的 2 mL 采样管中,编号并填写相应采样单。

发病禽鸟可无菌采集气管、肺、脑、肠(包括内容物)、肝、脾、肾、心等组织脏器,装入 15 mL 或 50 mL

带螺口的有机材料保存管中,编号并填写相应采样单。

【保存和运输】

采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h;若需长期保存,应放置-70℃以下保存,冻融不超过 3 次。。

【使用方法】

1.样品处理(样本处理区)

1.1样本前处理

将棉拭子充分捻动、挤干后弃去拭子;粪便,研碎的组织加 PBS 充分研磨,按照 1g 组织加 10 mL PBS 的比例配成悬液。样品液经 3 000 r/min 离心 10 min,取上清作为核酸检测材料。

1.2核酸提取

推荐采用公司生产的核酸提取或纯化试剂(磁珠法或离心柱法)进行核酸提取, 请按照试剂说明书进行操作。

2.试剂配制(试剂准备区)

根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;反应管数每满 10 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:

试剂IAV-N6 反应液酶液

用量19μL1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,20μL/管。

3.加样(样本处理区)

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀, 短暂离心。

4.PCR 扩增(核酸扩增区)

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;

4.2设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;荧光通道选择:

检测通道(Reporter Dye)FAM, 淬灭通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光, 选择 None 即可。

4.3推荐循环参数设置:

步骤循环数温度时间收集荧光信号

11 cycle50℃10min

21 cycle95℃2min

345 cycles95℃15sec

60℃30sec

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定(请参照各仪器使用说明书进行设置,以分析 ABI7500 仪器为例)

反应结束后自动保存结果,根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用户可根据实际情况自行调整,Start 值可设在 3~15、End 值可设在 5~20,使阈值线位于扩增曲线指数期,阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线),点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2结果判断

阳性:检测通道 Ct 值≤40,且曲线有明显的指数增长曲线; 阴性:样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。

5.3质控标准

阴性质控品:无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示;

阳性质控品:扩增曲线有明显指数增长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。

6.检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;

3.阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;

4.病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;

5.不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;

6.试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;

7.本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行;

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完-全混匀并短暂离心;

3.反应液应避光保存;

4.反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。


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