乙型流感病毒（IBV）核酸检测试剂盒说明书

【产品名称】

商品名称：乙型流感病毒（IBV）核酸检测试剂盒(荧光-PCR 法)

Name ：Influenza B virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】48T/盒

【预期用途】

乙型流感，是由乙(B)型流感病毒引起的流行性感冒，其特点是起病急骤，畏寒、发热，体温在数小时至 24 小时内升达高峰，39-40℃甚至更高。伴头痛，全身酸痛， 乏力，食欲减退。呼吸道症状较轻，咽干喉痛，干咳，可有腹泻。颜面潮红，眼结膜外眦充血，咽部充血，软腭上有滤泡

本试剂盒适用于检测的咽拭子、血清和痰等标本中乙型流感病毒 RNA，适用于乙型流感病毒感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒用一对乙型流感病毒特异性引物，结合一条特异性荧光探针，用一步法荧光 RT-PCR 技术对乙型流感病毒 RNA 进行体外扩增检测，用于科研上对可疑感染者的病原学检测。

【试剂组成】

名称规格

酶液50μL×1 管

IBV 反应液1.0mL×1 管

IBV 阳性质控品50μL ×1 管

阴性质控品250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

咽拭子：应使用与用采样拭子，适度拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部； 迅 速将拭 子放入 标本采集 管中， 旋 紧管盖 并密封， 以防干 燥。全血：疑似感染病人的静脉血 2mL 至 EDTA-2Na 抗凝管，8000rpm 离心 2min，取适量上清液于 1.5mL 灭菌离心管中。痰： 以清晨的第一口痰为宜。先用清水漱口， 嘱患者用力咳出深部的痰于无菌样本保存管，密封，即可送检。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

取适量样本于 1.5mL 灭菌离心管中，按 RNA 提取试剂盒说明书进行提取。

1.2RNA 提取

推荐采用公司生产的 RNA 提取试剂盒（离心柱提取法），请按照试剂盒说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂IBV 反应液酶液

用量20μL1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。

3.加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 RNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择：

检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，请勿选择 ROX 参比荧光。

4.3推荐循环参数设置：

步骤循环数温度时间收集荧光信号

11 cycle42℃20min否

21 cycle95℃10min否

340 cycles94℃15sec否

55℃30sec是

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线。

可疑：检测通道 Ct 值>35.0，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现 Ct 值≤35.0 和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

阴性：样本检测结果无 Ct 值且无明显的扩增曲线。

6.检测方法的局限性

6.1样本检测结果不样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

6.2样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

6.3阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

6.4病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

6.5不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6.6试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

6.7本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

7.质控标准

阴性质控品：无明显扩增曲线且无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完-全混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区与用工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。