猪圆环病毒 2 型(PCV-2)核酸检测试剂盒

【产品名称】

通用名称： 猪圆环病毒 2 型(PCV-2)核酸检测试剂盒(PCR 法)

Name ：Porcine Circovirus type II Detection Kit (PCR Method)

【包装规格】50T/盒

【预期用途】

猪圆环病是由猪圆环病毒（Porcine Circovirus）引起猪的一种传染性、先天性颤抖和断奶仔猪多系统功能障碍性疾病。该病毒具有 PCV1 和PCV2 两种血清型， PCV1 无致病性。PCV2 具有很强的免疫抑制作用，临床上常表现为多病原混合感染，PCV2 与断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）密切相关，还可引起猪皮炎与肾炎综合征、呼吸道综合征和 A2 型先天性震颤等疾病，给养猪业造成巨大经济损失。因此PCV2 感染早期诊断尤为重要。

本试剂盒适用于检测从肺、淋巴结组织、全血等标本中分离出的猪圆环病毒 2 型 DNA，用于猪圆环病毒 2 型的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒用一对猪圆环病毒 2 型特异性引物，对猪圆环病毒 2 型 DNA 进行体外扩增检测，用于科研实验中对可疑感染者的病原学检测。

【试剂组成】

名称规格

PCV-2 反应液550μL×2 管

PCV-2 阳性质控品50μL ×1 管

阴性质控品250μL ×1 管

注：

1）不同批号试剂不能混用。

2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

4.PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于 PCR 仪反应槽内；

4.2推荐循环参数设置：

步骤循环数温度时间

11 cycle94℃2min

2

35 cycles94℃30sec

58℃30sec

72℃60 sec

反应体系为 25μL；

5.电泳检测

1)2%琼脂糖凝胶配制：稀释 50×TAE 缓冲液至 1×TAE (取 20mL 50×TAE 缓冲液， 加 980mL 双蒸水至 1L)，称 4g 琼脂糖放于 500mL 锥形瓶中，1×TAE 缓冲液 200 mL，置入微波炉中加热熔解(避免加热沸腾溶液外溢)，再加入 10μL 染料充分混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后使用；

2)电泳：在电泳槽中加入 1×TAE 缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。用移液器取 10μ L PCR 扩增产物于琼脂糖凝胶孔中。加样后，以 5V/cm 电压，电泳 20-30min（每次电泳时，每隔 10min 观察一次。当加样缓冲液中溴酚蓝电泳过半至凝胶下 2/5 处时，可停止电泳）。电泳后，紫外灯下观察结果。

6.结果判定

阳性质控品出现 1154 bp 条带，阴性质控品不出现条带或只出现片段较小的引物二聚体条带，实验结果成立。被检样品出现 1154 bp 条带，判断为阳性，否则为阴性。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融不超过 5 次，有效期 12 个月。

【所需仪器】

PCR 仪、电泳仪、紫外凝胶成像仪等

【标本采集】

病死或扑杀的猪，取肺、淋巴结等组织；待检活猪，用注射器取血 5mL

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标

本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

组织样品：每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中； 全血样本：待血凝固后，取血清放于离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清 100 μL 于灭菌离心管中

1.2DNA 提取

采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的 DNA 提取试剂盒（离心柱提取法），请

按照试剂盒说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂PCV-2 反应液

用量（样本数为 N）21μL

3.加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于 PCR 仪反应槽内；

4.2推荐循环参数设置：

步骤循环数温度时间

11 cycle94℃2min

2

35 cycles94℃30sec

58℃30sec

72℃60 sec

反应体系为 25μL；

5.电泳检测

1)2%琼脂糖凝胶配制：稀释 50×TAE 缓冲液至 1×TAE (取 20mL 50×TAE 缓冲液， 加 980mL 双蒸水至 1L)，称 4g 琼脂糖放于 500mL 锥形瓶中，1×TAE 缓冲液 200 mL，置入微波炉中加热熔解(避免加热沸腾溶液外溢)，再加入 10μL 染料充分混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后使用；

2)电泳：在电泳槽中加入 1×TAE 缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。用移液器取 10μ L PCR 扩增产物于琼脂糖凝胶孔中。加样后，以 5V/cm 电压，电泳 20-30min（每次电泳时，每隔 10min 观察一次。当加样缓冲液中溴酚蓝电泳过半至凝胶下 2/5 处时，可停止电泳）。电泳后，紫外灯下观察结果。

6.结果判定

阳性质控品出现 1154 bp 条带，阴性质控品不出现条带或只出现片段较小的引物二聚体条带，实验结果成立。被检样品出现 1154 bp 条带，判断为阳性，否则为阴性。

7.产品性能指标

试剂灵敏性 10-3 以上，特异性 100%，批间批内差异≤3%。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完-全混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全   通则》进行处理。

【参考文献】

[1]许立华, 芦银华等. 猪圆环病毒研究进展[J]. 中国病毒学, 2004, 19(3): 288-290.

[2]杨汉春. 猪免疫抑制性疾病的流行特点与控制对策[J].中国畜牧兽医, 2004.

[3]Wellenberg G, Pesch S, Berndsen F. Isolation and characterization of porcine circovirus type 2 from pigs showing signs of postweaning multi- systemic wasting syndrome in Netherlands [J]. Veterinary Quarterly, 2000, 22(3): 167-172.