【产品名称】
通用名称:猪多杀性巴氏杆菌(SPA)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)
Name:Swine Pasteurellosis Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】50T/盒
【预期用途】
多杀性巴氏杆菌是一种常见病原菌,可感染猪、牛、家禽等多种动物,引起猪肺疫、牛出血性败血症、禽霍 乱等多种临床疾病[1]。
本试剂盒适用于检测气管分泌物拭子、肺组织等样本中的猪多杀性巴氏杆菌,用于猪多杀性巴氏杆菌感染的 辅助诊断。
【检验原理】
本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术,设计一对猪多杀性巴氏杆菌特异性引物,结合一条特异性探针[2],用荧光 PCR 技术对猪多杀性巴氏杆菌的 DNA 进行体外扩增检测,用于科研实验中对可疑感染者的病原学检测。
【试剂组成】
包装规格50T/盒
SPA 反应液500μL×2 管
酶液50μL×1 管
SPA 阳性质控品50μL ×1 管
阴性质控品250μL ×1 管
说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】
病死或扑杀猪,无菌采集肺病变部位或病变/非病变部位交界处的样品;生猪灭菌棉拭子沾取气管分泌物, 放入无菌试管中
【保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标本运送应采用 2~8℃冰袋运输, 严禁反复冻融。
【使用方法】
1.样品处理(样本处理区)
1.1样本前处理
组织样品:称取样品约 1g,手术剪剪碎混匀后于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中,8000rpm 离心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中
1.2核酸提取
推荐采用优利科(上海)生命科学有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(磁珠法或离心柱法)进行核酸提取,请按照 试剂说明书进行操作。
2.试剂配制(试剂准备区)
根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;反应管数每满 10 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:
试剂SPA 反应液酶液
用量(样本数为 N)20μL1μL
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,21μL/管。
3.加样(样本处理区)
将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心。
4.PCR 扩增(核酸扩增区)
4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;
4.2设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;
荧光通道选择: 检测通道(Reporter Dye)FAM, 淬灭通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列仪器请勿选择
ROX 参比荧光,选择 None 即可。
4.3推荐循环参数设置:
步骤循环数温度时间收集荧光信号
11 cycle95℃10min否
240 cycles94℃15sec否
55℃30sec是
5.结果分析判定
5.1结果分析条件设定
设置 Baseline 和 Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节),以及 Threshold 的Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。
5.2结果判断
阳性:检测通道 Ct 值≤35,且曲线有明显的指数增长曲线;
可疑:检测通道 35<Ct 值≤38,建议重复检测,如果检测通道仍为 35<Ct 值≤38,且曲线有明显的增长曲线, 判定为阳性,否则为阴性;
阴性:样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。
6.质控标准
阴性质控品:Ct 值>38 或无 Ct 值;
阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。
7.检测方法的局限性
1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;
2.样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;
3.阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;
4.病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;
5.不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;
6.试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;
7.本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
【注意事项】
1.所有操作严格按照说明书进行;
2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完-全混匀并短暂离心;
3.反应液应避光保存;
4.反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;
5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;
6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;
8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
【参考文献】
[1]曾静雯, 刘慧芳, 沈琴芳, 等. 多杀性巴氏杆菌鉴定与特性研究的分子生物学方法[J]. 中国兽药杂志, 2006.
[2]李鹏, 马艳娇, 夏伟, 等. 猪肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌三重 PCR 检测方法的建立. 中国预防兽医学报, 2010.
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