猪肺炎支原体（MHP）核酸检测试剂盒

【产品名称】

通用名称：猪肺炎支原体（MHP）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）

Name：Mycoplasma hyopneumoniae Detection Kit（Real-Time PCR Method）

【包装规格】25T/盒、50T/盒

【预期用途】

猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae, MHP）可引起猪支原体肺炎，该病又称猪霉形体肺炎或猪气喘病，是猪的一种高发性的慢性呼吸道传染病，主要临床表现为咳嗽和气喘，病理变化以患猪肺心叶、尖叶的背侧和横隔叶的前端肉样病变为特征[1]。该病一年四季均可发病，但以冬、春寒冷季节较常见，各种日龄猪均可发病。    病猪生长缓慢，饲料利用率低，给世界各国养猪业造成了重大经济损失。

本试剂盒适用于检测气管分泌物拭子、肺组织等样本中的猪肺炎支原体，用于猪肺炎支原体感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒对猪肺炎支原体基因保守区设计特异性的引物和探针[2-3]，用荧光 PCR 技术对猪肺炎支原体的DNA

进行体外扩增检测，用于对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

包装规格25T/盒50T/盒

MHP 反应液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

MHP 阳性质控品50μL ×1 管50μL ×1 管

阴性质控品250μL ×1 管250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

病死或扑杀猪，无菌采集肺病变部位或病变/非病变部位交界处的样品；生猪灭菌棉拭子沾取气管分泌物，   放入无菌试管中

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输， 严禁反复冻融。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

组织样品：每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入

1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL

灭菌离心管中；棉拭子取 100μL 进行提取。

1.2 核酸提取

推荐采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，   请按照试剂说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N（N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表：

试剂MHP 反应液酶液

用量（样本数为 N）20μL1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21μL/管。

3.加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择

ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3推荐循环参数设置：

步骤循环数温度时间收集荧光信号

11 cycle95℃10min否

240 cycles94℃15sec否

55℃30sec是

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值（一般可在 3~15 范围内调节）、stop 值（一般可在 5~20 范围内调节），以及 Threshold的 Value 值（上下拖动阈值线至高于阴性对照），重新分析结果。

5.2结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；

可疑：检测通道 35<Ct 值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为 35<Ct 值≤38，且曲线有明显的增长曲线， 判定为阳性，否则为阴性；

阴性：样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。

6.质控标准

阴性质控品：Ct>38 或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7.检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完-全混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

[1]李莹莹,何颖, 赵武, 等。猪支原体肺炎研究进展[J]. 动物医学进展, 2013,34（10）: 95-100

[2]张旭, 白方方, 武昱孜,  等. PCR 技术检测猪支原体肺炎的研究进展[J]. 生物技术通报, 2012（5）: 54-60.

[3]Dubosson C R, Conzelmann C, Miserez R, et al. Development of two real-time PCR assays for the detection of Mycoplasma hyopneumoniae in clinical samples [J]. Veterinary microbiology, 2004, 11: 55-65.