简要描述:猪细小病毒(PPV)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)适用于检测肠系膜淋巴结、肝脏、肾、肺、肝、脑、睾丸、胎盘的肺和淋巴结、全血等样本中的猪细小病毒,用于猪细小病毒感染的辅助诊断。
产品分类
Product Category详细介绍
品牌 | YLKBIO | 货号 | YLK10053P |
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规格 | 50T | 供货周期 | 现货 |
主要用途 | 科研实验 | 应用领域 | 化工,生物产业 |
英文名称 | Porcine Parvovirus Detection Kit (Real-Time PCR Me | 保存条件 | -20℃±5℃,避光保存 |
有效期 | 12个月 | 试剂盒说明 | 不同批号的试剂盒组分不可交互使用 |
标本运输 | 采用 2~8℃冰袋运输 |
猪细小病毒(PPV)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)
通用名称:猪细小病毒(PPV)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)
Name :Porcine Parvovirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】50T/盒
【预期用途】
猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)是引起母猪流产和新生仔猪死亡的主要病原体之一,同时也能引起某些皮肤病和腹泻[1-2],严重影响猪群的健康和正常生产,己经给世界养猪业造成了很大的经济损失。本病主要表现为流产、产死胎和木乃伊胎,母猪通常不表现临床症状。实时荧光定量 PCR 将常规 PCR 技术与荧光检测相结合,不仅具有敏感性高、特异性强、用时短等优点,而且通过分析软件对数据进行分析整理,结果更为准确直观, 已成为病原体检测的重要方法[3]。
本试剂盒适用于检测肠系膜淋巴结、肝脏、肾、肺、肝、脑、睾丸、胎盘的肺和淋巴结、全血等样本中的猪细小病毒,用于猪细小病毒感染的辅助诊断。
【检验原理】
本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术,设计一对猪细小病毒特异性引物,结合一条特异性探针, 用荧光 PCR 技术对猪细小病毒的 DNA 进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。
【试剂组成】
包装规格 | 50T/盒 |
PPV 反应液 | 500μL×2 管 |
酶液 | 50μL×1 管 |
PPV 阳性质控品 | 50μL ×1 管 |
阴性质控品 | 250μL ×1 管 |
说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】
疑似感染仔猪取肠系膜淋巴结或肝脏;流产或死胎的肾、肺、肝、脑、睾丸和胎盘肺、淋巴结等组织;待检 活猪,用注射器取血 5mL
【保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标本运送应采用 2~8℃冰袋运输, 严禁反复冻融。
【使用方法】
1. 样品处理(样本处理区)
1.1 样本前处理
组织样品:每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g,手术/剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入1.5mL 生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中,8000rpm 离心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中;全血样本:待血凝固后,取血清 100μL 于灭菌离心管中。
1.2 核酸提取
推荐采用公司生产的 DNA/提取试剂盒(离心柱提取法),请按照试剂盒说明书进行操
作。
2. 试剂配制(试剂准备区)
根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;反应管数每满 10 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:
试剂 | PPV 反应液 | 酶液 |
用量(样本数为 N) | 20μL | 1μL |
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,21uL/管。
3. 加样(样本处理区)
将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心。
4. PCR 扩增(核酸扩增区)
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;
4.2 设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;
荧光通道选择: 检测通道(Reporter Dye)FAM, 淬灭通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列仪器请勿选择
ROX 参比荧光,选择 None 即可。
4.3 推荐循环参数设置:
步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | 收集荧光信号 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
2 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定
设置 Baseline 和 Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节),以及 Threshold的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。
5.2 结果判断
阳性:检测通道 Ct 值≤35,且曲线有明显的指数增长曲线;
可疑:检测通道 35<Ct 值≤38,建议重复检测,如果检测通道仍为 35<Ct 值≤38,且曲线有明显的增长曲线, 判定为阳性,否则为阴性;
阴性:样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。
6. 质控标准
阴性质控品:Ct>38 或无 Ct 值显示;
阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。
7. 检测方法的局限性
1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;
2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;
3. 阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;
4. 病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;
5. 不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;
6. 试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;
7. 本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
【注意事项】
1. 所有操作严格按照说明书进行;
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化,混匀并短暂离心;
3. 反应液应避光保存;
4. 反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;
5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;
6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
7. 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;
8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
【参考文献】
[1] Mengeling W L. Prevalence of porcine parvovirus induced reproductive; an abattoir study [J]. Am Vet Med Assoc, 1978, 172: 1291-1294.
[2] Den S. Parvovirus-like particle associated with diarrhea in unweaned piglets [J]. Can Comp Med, 1985, 49: 343-345. [3]殷 震, 刘景华. 动物病毒学[M] . 2 版. 北京: 科学出版社, 1997.
[4] 国家质量监督检验检疫总局. SN/T 1919-2016 猪细小病毒病检疫技术规范[S].
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