简要描述:两管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)是整合 cDNA 第一链合成试剂和即用型 PCR 试剂而得的 RT-PCR 试剂盒。cDNA 第一链合成反应和PCR 反应分别在两个离心管中进行。
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品牌 | YLKBIO | 货号 | YLK10360P |
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规格 | 50T | 供货周期 | 现货 |
主要用途 | 科研实验 | 应用领域 | 化工,生物产业 |
英文名称 | Two-Tube RT-PCR Kit | 运输: | 低温运输 |
保存条件: | -20℃ | 有效期: | 12个月 |
自备试剂 | 样品 RNA、模板专一正向和反向引物 |
两管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)说明书
中文名称:两管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)
英文名称:Two-Tube RT-PCR Kit(AMV-Taq)
本试剂盒是整合 cDNA 第一链合成试剂和即用型 PCR 试剂而得的 RT-PCR 试剂盒。cDNA 第一链合成反应和PCR 反应分别在两个离心管中进行。
规格及成分:
成分 | 50次塑料袋包装 |
RT试剂盒 | 50 次 |
即用型PCR试剂盒 | 9 ml |
使用手册 | 1 份 |
RT试剂盒成分表:
RT试剂盒成分 | 50次包装 |
MMLV逆转录酶(含RT) | 100 ul |
RTBuffer (含dNTP) | 300 ul |
Oligo(dT)18引物(0.5ug/ul) | 50 ul |
随机引物(0.2ug/ul) | 50 ul |
RNase-free 水 | 10 ml |
即用型 PCR 试剂盒成分表:
即用型PCR 试剂盒 3.0 成分 | 600 次包装 |
PCR MagicMix 3.0 | 9 mL |
专用染料 | 360 uL |
两管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)具有以下特点:
1.即开即用,足够 50 次 RT 反应(20 uL 体系)和 600 次PCR 反应(30 uL 体系)。
2.cDNA 第一链合成试剂盒可灵活选用随机引物、Oligo dT 引物或基因专一引物,适合各种情况。
3.PCR 试剂盒具有即用、简单等优点,PCR mix 中含上样染料,所以 PCR 产物可以直接上样电泳。
4. 两管式操作,RT 和PCR 在不同试管中进行,便于单独优化 RT 反应或PCR 反应条件。
5.扩增效率高, 最长可扩增 5 Kbp 以上的 RNA。
运输及保存
低温运输,-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂
样品 RNA、模板专一正向和反向引物。
使用方法:
一、样品 RNA 的制备(本试剂盒不提供相关试剂)
可用自本公司各种 RNA 提取方法提取样品的 RNA,也可以选用其他供应商的产品,但得到的 RNA 一定要溶解在RNase-free 的超纯水中。
二:RT(逆转录)反应合成 cDNA
1.按下表配制 RT 反应体系(20 uL 体系):
RNA 模板 | |
总 RNA | 100-500 ng |
或 poly(A) mRNA | 10-500 ng |
或专一的 RNA(如体外转录制备的) | 0.01 pg-500 ng |
引物 | |
Oligo (dT)18(0.5 ug/uL) | 1 uL |
或随机引物(0.2 ug/uL) | 1 uL |
或自备模板专一反向引物(10 pmol/uL) | 1-2 uL |
RNase-free 水 | 补水到 12 uL |
注意:RNA 样品不能含有基因组 DNA 污染。随机引物与 RNA 模板的比例将决定cDNA 合成的平均长度(成反比)。一般情况下随机引物效率好于 OligodT 引物,但如果只想转录总 RNA 中的 mRNA(只占 5%左右),则可优先选用 OligodT 引物,这样就可以排除非mRNA 的干扰。
2.70℃保温 5 分钟变性模板后立即冰浴。
3.按顺序加入 6 uL RT Buffer(含 dNTP)和 2 uLMMLV 逆转录酶(含 RI),反应终体积为 20 uL。
4.42℃保温 60 分钟。此步为 RT 反应。
5.70℃保温 10 分钟以终止反应,然后放置在冰上待用。
6.合成的 cDNA 可以直接作为 PCR 模板使用,不需要纯化。剩余样品可以放置在-20℃长期保存。
三、PCR(30 uL 体系)
1、将全部专用染料加入到PCR MagicMix 3.0 中,轻柔颠倒混匀即可使用。未用完的部分需要在-20℃。也可以不加专用染料,但在 PCR 结束后,电泳上样前,则需要加入电泳上样液,否则电泳时没法判断电泳速度。
2、在 PCR 管中加入下列成分:
成分 | 加入量 |
PCR MagicMix 3.0(已加染料) | 15 uL |
cDNA 样品(上步的 RT 反应液) | 1-5 uL |
模板专一性正向引物(10 pmol/uL) | 1-2 uL |
模板专一性反向引物(10 pmol/uL) | 1-2 uL |
补水到 | 30 uL |
注意:cDNA 也可以稀释后用作 PCR 模板。是否稀释或稀释多少倍wan全取决于靶基因的丰度。
PCR 反应参数(需要根据模板和引物决定,下面的只做参考):
过程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 94℃ | 5min |
PCR反应 (35个循环) | 94℃ | 1min |
55℃ | 1min | |
72℃ | 2min | |
最后延伸 | 72℃ | 10min |
四、电泳检测
1、取 5-0 uL PCR 产物直接在PAGE 或琼脂糖凝胶上电泳,跟分子量标准比较估计出扩增产物的大小。注:本试剂盒中的PCR mix 含有甘油和染料,可以直接上样,不需要
额外再加电泳上样液。
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