简要描述:硫氧还蛋白氧化还原酶(TrxR)试剂盒测定意义:TrxR 是一种 NADPH 依赖的包含 FAD 结构域的二聚体硒酶,属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员,与硫氧还蛋白以及 NADPH 共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR 与 GR 活性类似,催化 GSSG 还原生成 GSH,是谷胱/甘肽氧化还原循环关键酶之一。
产品分类
Product Category详细介绍
品牌 | YLKBIO | CAS | 详见说明书 |
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分子式 | 详见说明书 | 纯度 | 详见说明书 |
分子量 | 详见说明书 | 货号 | YLK-SH127 |
规格 | 100管/96样、50管/48样 | 供货周期 | 现货 |
主要用途 | 科研 | 应用领域 | 化工,生物产业 |
测定方法: | 微量法、可见分光光度法 |
硫氧还蛋白氧化还原酶(TrxR)试剂盒说明书
微量法100T/96S
注 意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
TrxR 是一种 NADPH 依赖的包含 FAD 结构域的二聚体硒酶,属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员,与硫氧还蛋白以及 NADPH 共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR 与 GR 活性类似,催化 GSSG 还原生成 GSH,是谷胱/甘肽氧化还原循环关键酶之一。
测定原理:
TrxR 催化 NADPH 还原 DTNB 生成 TNB 和 NADP+,TNB 在 412 nm 有特征吸收峰,通过测定 412nm 波长处 TNB 的增加速率,即可计算 TrxR 活性。
自备仪器和用品:
低温离心机、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体 120mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:液体 2mL×1 瓶,4℃避光保存。
试剂三:粉剂×1 管,4℃保存。临用前加入 2mL 蒸馏水溶解。
粗酶液提取:
1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体:直接测定。
TrxR 测定操作:
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min,调节波长到 412nm,用蒸馏水调零。
2. 试剂一在 25℃(一般物种)或者 37℃(哺乳动物)预热 30min。
3. 空白管:取微量玻璃比色皿或 96 孔板,加入 20μL 试剂二,20μL 试剂三,160μL 试剂一,迅速混匀后于 412 nm 测定 10 s 和 310 s 吸光度,记为 A1 和 A2。△A 空白管=A2-A1。
4. 测定管:取微量玻璃比色皿或 96 孔板,加入 20μL 试剂二,20μL 试剂三,140μL 试剂一, 20μL 上清液,迅速混匀后于 412 nm 测定 10 s 和 310 s 吸光度,记为 A3 和 A4。△A 测定管
=A4-A3。
注意:空白管只需测定一次。
TrxR 活性计算公式:
(1). 按蛋白浓度计算
活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每毫克蛋白每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。
TrxR(nmol/min /mg prot)=(△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T = 147×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr
(2). 按样本质量计算
活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每克样本每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。
TrxR(nmol/min /g 鲜重)=(△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T
= 147×(△A 测定管-△A 空白管)÷W
(3)按细胞数量计算
活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每 104 个细胞每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶
活单位。
TrxR(nmol/min/104 cell)=(△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样
总)÷T
= 147×(△A 测定管-△A 空白管)÷ 细胞数量
(4)按液体体积计算
活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每毫升液体每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。
TrxR(nmol/min /mL)=(△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T
= 147×(△A 测定管-△A 空白管)
ε:TNB 在 412nm 处的微摩尔消光系数,0.0136 L/μ mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 反总:
反应体系总体积(L),200μL=2×10-4 L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定;
W :样品质量;V 样:加入反应体系中上清液体积(mL),20μL=0.02 mL;V 样总:提取液体积,1 mL;T:反应时间(min),5 min。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
(1). 按蛋白浓度计算
活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每毫克蛋白每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活
单位。
TrxR(nmol/min /mg prot)=(△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T
= 294×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr
(2). 按样本质量计算
活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每克样本每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。
TrxR(nmol/min /g 鲜重)=(△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T
= 294×(△A 测定管-△A 空白管)÷W
(3)按细胞数量计算
活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每 104 个细胞每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶
活单位。
TrxR(nmol/min/104 cell)=(△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样
总)÷T
= 294×(△A 测定管-△A 空白管)÷ 细胞数量
(4)按液体体积计算
活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每毫升液体每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。
TrxR(nmol/min /mL)=(△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T
= 294×(△A 测定管-△A 空白管)
ε:TNB 在 412nm 处的微摩尔消光系数,0.0136 L/μ mol/cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 反总:反应体系总体积(L),200μL=2×10-4 L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定;W :样品质量;V 样:加入反应体系中上清液体积(mL),20μL=0.02 mL;V 样总:提取液体积,1 mL;T:反应时间(min),5 min。
注意事项:
1. 测定前须先取 1~2 个样做预实验,使得吸光值在 5min 内程线性变化。哺乳动物组织及血液制品 TrxR 活力测定时,一般须用蒸馏水稀释 5 倍左右;测定过程操作须迅速。
2. 试剂二和试剂三配制好后 3 天内使用完。
硫氧还蛋白氧化还原酶(TrxR)试剂盒仅供科研!
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