简要描述:NADP磷酸酶(NADPase)试剂盒测定意义:NADPase主要存在于植物组织中,是生物体内唯yi催化NADP+降解为NAD+的酶,与NADK一起调控NAD和NADP之间的平衡。
产品分类
Product Category详细介绍
品牌 | YLKBIO | CAS | 详见说明书 |
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分子式 | 详见说明书 | 纯度 | 详见说明书 |
分子量 | 详见说明书 | 货号 | YLK-SH125 |
规格 | 100管/96样、50管/48样 | 供货周期 | 现货 |
主要用途 | 科研 | 应用领域 | 化工,生物产业 |
测定方法: | 微量法、可见分光光度法 |
NADP磷酸酶(NADPase)试剂盒说明书
微量法 100管/96样
注 意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
NADPase主要存在于植物组织中,是生物体内唯yi催化NADP+降解为NAD+的酶,与NADK一起调控NAD和NADP之间的平衡。
测定原理:
NADPase能够催化NADP+水解为NAD+和无机磷的反应,通过测定无机磷的量来测定NADPase活性。
所需的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水
试剂的组成和配制:
提取液:100mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体15 mL×1瓶, 4℃保存。
试剂二:粉剂×4支,-20℃保存;用时加入1 mL试剂一充分溶解备用,现配现用。
试剂三:粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入25mL蒸馏水,溶解后4℃可保存一周。
试剂四:粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25mL蒸馏水,溶解后4℃可保存一周。
试剂五:液体 25mL×1 瓶,室温保存。
试剂六:10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶,4℃保存。
0.5μmol/mL 标准磷应用液配制:将试剂六20倍稀释,即取 0.5mL试剂六加9.5蒸馏水,充分混匀。
定磷试剂的配制:按H2O: 试剂三:试剂四:试剂五=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷试剂
应为浅黄色,若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染,定磷剂现用现配。
注意:配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。
样本的前处理:
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
操作步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至660nm,蒸馏水调零。
2、酶促反应(在EP管中加入下列试剂)
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
试剂一 | 120 | 120 |
试剂二 | 40 | 40 |
37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热5min
样本 | 40 | |
蒸馏水 | 40 |
37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确反应30min后,95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失),冷却后,10000g 25℃离心5min,取上清
3、定磷(在EP管或96孔板中加入下列试剂)
标准管 | 空白管 | 测定管 | 对照管 | |
0.5μmol/ml标准磷应用液 | 20 | |||
蒸馏水 | 20 | |||
上清液 | 20 | 20 | ||
定磷试剂 | 200 | 200 | 200 | 200 |
混匀,25℃室温放置30min,在 660nm处,记录各管吸光值。
注意事项:
1、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格,要没有一点磷,若试管放过磷酸或磷酸盐缓冲液,一定要洗得非常干净,要先用洗洁精加水煮,再用自来水冲,最后用蒸馏水冲干净。最好用一次性塑料管或新玻璃管,避免磷污染是检测成败的关键。
2、标准管、空白管和对照管只要做一次即可。
NADPase酶活性计算:
1、按组织蛋白浓度计算:
定义:每小时每毫克组织蛋白NADPase分解NADP 产生1μmol无机磷的量为一个 NADPase活力单位。
NADPase (μmol/h/mg prot)=(C标准管×V总)×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷
(V样×Cpr)÷T=5×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr
2、按样本鲜重计算:
定义:每小时每g组织NADPase分解NADP 产生1μmol无机磷的量为一个 NADPase活力单位。
NADPase (μmol/h /g鲜重)=(C标准管×V总)×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V总÷(W× V样÷V样总)÷T=5×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W
C标准管:标准管浓度,0.5μmol/mL;V总:酶促反应总体积,0.2mL;V样:加入样本体积,0.04mL ;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,0.5小时;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g。
NADP磷酸酶(NADPase)试剂盒仅供科研!
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