简要描述:人类白细胞抗原A基因染料法PCR试剂盒人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)是人类的主要组织相容性复合体(MHC)的表达产物,该系统是目前所知人体最复杂的多态系统。
产品分类
Product Category详细介绍
品牌 | YLKBIO | 货号 | YLK10396P |
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规格 | 50T | 供货周期 | 现货 |
主要用途 | 科研实验 | 应用领域 | 化工,生物产业 |
保存条件 | 低温运输,-20℃保存 | 有效期 | 12个月 |
试剂盒说明 | 不同批号的试剂盒组分不可交互使用 |
人类白细胞抗原A基因染料法PCR试剂盒
产品名称:人类白细胞抗原A基因染料法PCR试剂盒
英文名称:Human Leukocyte Antigen-A(HLA-A)SYBR qPCR Kit
人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)是人类的主要组织相容性复合体(MHC)的表达产物,该系统是目前所知人体最复杂的多态系统。 根据基因产物的结构,功能,细胞分布等因素,将 HLA 基因分成了 3 大类,其中 HLA-I 型基因,包括了 HLA-A,HLA-B,HLA-C 等经典的抗原基因。本产品就是以荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测 HLA-A 基因的试剂盒,它具有下列特点:
1. 即开即用,用户只需要提供 DNA 模板。
2. 特异性高,引物是根据 HLA-A 基因高度保守区设计,不会扩增其他基因。
3. 引物和扩增体系经过优化,灵敏性比常规 PCR 高 100 倍。
4. 提供无传染性的 PCR 阳性对照,便于区分假阴性样品。
5. 一管式操作,荧光 PCR 检测,不容易产生环境污染。
6.本产品只能用于科研,本试剂盒足够 50 次 20μL 体系的 PCR。
【试剂组成】
成分 | 十孔盒包装 |
2×qPCR MagicMix | 500μL(棕色) |
荧光 PCR 专用模板稀释液 | 1 mL(黄盖) |
HLA-A 基因染料法 qPCR 引物 混合液 | 100 μL(白盖) |
HLA-A 基因染料法 qPCR 阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL) | 1mL(绿盖) |
核酸释放剂试用装 | 1mL(绿盖) |
使用手册 | 1 份 |
【运输及保存】低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月。
【自备试剂】样品 RNA。
【注意事项】
一、制备标准曲线样品(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原, 本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1.标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。
2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同)。
3.在 7 号管中加入 5 μL 阳性对照(其浓度为 1×10E8 拷贝/μL,试剂盒提供),充分震荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7.用自选方法纯化样品的 DNA,本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。
8.如果有 N 个样品,则需要进行 N+2 个样品提取,多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。本试剂盒免费赠送1ml免DNA提取的核酸释放剂试用装,该释放剂的裂解液可以直接作为PCR 模板,省略了 DNA 提取步骤。
三、设置 qPCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)
9.如果进行定量分析,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照,6 个用于标准曲线样品。如果做定性分析,则 6 个标准曲线样品只选一个做(可以选 4 号,其余样品不变)。以下只介绍定量分析的反应设置。
10.在标记管中按下表加入各成分:
成分 | N+2 个 样品管 | PCR 阴性 对照管 | 标准曲线 样品管(2-7 管) |
2×qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
HLA-A 基因染料法 qPCR 引物 混合液 | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
自备 10×ROX (见注) | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
N+2 个待测样品 DNA 模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
自备超纯水 | 不加 | 6 μL | 不加 |
第 7 步所得标准曲线样品稀释液 (2-7 号) |
不加 |
不加 | 各 6μL(2 号样到 2 号管,3 号样到 3号管…) |
注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照,其他荧光 PCR 仪器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、 RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480) 不需要使用 ROX,则用水替代。
11.盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR(具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化)。
四、荧光定量 PCR 反应参数
过程 | 温度 | 时间 |
预热 | 50℃ | 2 min |
预变性 | 95℃ | 10 min |
PCR 反应 (40 个循环) | 95℃ | 15 sec |
60℃ | 1 min(采集 SYBR 通道的荧 光信号) | |
按仪器预设程序进行溶解曲线分析 |
五、数据处理
12. 设定 60℃-96℃范围的融解曲线分析,排除假阳性。
13. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品DNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。
14. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40 则为阴性,如果小于 40,则为阳性。
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